Eesti Huumorimuuseumi tegevuseks on huumoriga seotud esemete kogumine, säilitamine ja eksponeerimine, huumoriõhtute- ja loengute läbiviimine, karikatuuri ja sarži töötubade korraldamine ning kõik muu, mis mahub mõiste huumor alla. Muuseumi huvisfääris on kõik, mis on seotud huumoriga, eeskätt eesti huumorikultuuriga.